罗红梅 邓文娣 陈颂 吴小闲
广州中医药大学热带医学研究所 510405
[摘要]目的：观察猴免疫缺陷病毒（SIV）感染猕猴后循环免疫复合物（CIC）的动态变化。方法：使用SIVmac251感染30只实验猴，并在感染SIV后不同时间点取样，采用补体致敏的酵母菌凝集试验，检测血清CIC水平的变化。并同时检测了68例正常猴的血清作为对照。结果：30例SIV感染猴在接种后第4周开始检出CIC（30％），第8周迅速升高并到达高峰46.7％，在第16周降低至33.3%并逐渐下降。从第20周开始，感染猴的CIC浓度维持于一较低的滴度和阳性率，接近于正常猴（约10％）。结论：CIC在SIV急性感染期间出现并升高，但其后伴随着循环中病毒的减少，CIC也逐渐下降。
[关键词]猕猴；猴免疫缺陷病毒；循环免疫复合物
AIDS是危及全球数千万生命安全的重大疾病。现在的研究普遍认为，免疫缺陷的形成并不是由于HIV直接破坏免疫细胞所引起，宿主的免疫应答与HIV的相互作用似乎起着更为重要的作用。
免疫复合物的形成是机体的一个重要防御机制，它有助于将病原体从循环中清除，但另一方面，免疫复合物的沉着可能产生系列复杂的级联效应，导致广泛的微血管病变和组织损伤。此过程在HIV感染的免疫病理中是否产生作用，正越来越引起人们的关注。
猴免疫缺陷病毒（SIV）感染是研究人类艾滋病的最佳动物模型，在病毒学、宿主的免疫应答及免疫病理等各方面均与HIV感染导致的病变极为相似。本实验研究了SIV感染后猴血清循环免疫复合物（circulating immune complex, CIC）的变化，对了解其形成规律及其在AIDS病程中的作用将有所帮助。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康成年恒河猴和食蟹猴，雌雄不限。购买并饲养于广东省灵长类实验动物中心，经血清学检测猴逆转录D型病毒（SRV）和猴T淋巴细胞性I型病毒（STLV-I）抗体阴性，结核菌素试验阴性。在感染SIV后不同时间点上（见表2）收集血清进行检测，以感染SIV前的正常猴血清作为对照。
1.2 SIV病毒及感染 来源于美国Aarond Diamond艾滋病研究中心Marx博士赠予的SIVmac251病毒液，用健康猴PBMC体外增殖病毒，收集后分装、滴定、冻存。以 5 MID100 剂量静脉注射1ml感染实验猴。
1.3 循环免疫复合物的测定 采用补体致敏酵母菌凝集试验［1］。酵母冻干试剂购自上海长海医院输血科血液免疫研究室，经过本室自行制备的无菌豚鼠血清37℃水浴15min进行致敏。生理盐水洗涤后，计数并调整密度至2×107/ml备用。
将待测血清稀释成1:8、1:16和1:32三个浓度，各取100μl加入含100μl已致敏的酵母菌液之中，混匀，37℃水浴30分钟，用生理盐水洗涤后，离心弃上清，再加入1:15的兔抗人IgG多克隆抗体（上海生物制品研究所生产）100μl，充分混匀，4℃反应3小时后，轻轻摇匀各管，取样滴片后低倍显微镜下观察结果。
判定标准参考文献［1］：“+”：轻度凝集无絮状物出现，“++”：中小度凝集并出现少许絮状物，“+++”：为中大块凝集并出现明显絮状物，“++++”：为大块凝集，显著絮状物。以≥1：8出现“＋”为阳性，1：16为较强阳性，1：32为强阳性。
2 结果与分析
2.1 正常猴循环免疫复合物的水平
我们共检测30例正常食蟹猴和38例正常恒河猴，体重3~5kg，年龄均为3～5岁。观察到部分正常猴也可有CIC的存在，但含量一般较少。总阳性率为10.3%（其中食蟹猴6.67%，恒河猴13.16%）。经Ridit分析，两组差异不显著（P>0.05），见表1。
表1 正常猴CIC阳性的分布情况
|
组别 |
例数 |
CIC（n） |
阳性率（％） |
|
<1：8 |
1：8 |
1：16 |
1：32 |
|
食蟹猴 |
30 |
28 |
0 |
2 |
0 |
6.67％ |
|
恒河猴 |
38 |
33 |
5 |
|
0 |
13.16％ |
2.2 SIV感染后不同时间点CIC的变化
我们共检测了30只实验猴（包括食蟹猴和恒河猴）在感染SIV后2周、4周、8周、16周、20周、28周的血清样本，观察到血清CIC在感染SIV后2周仍呈阴性，4周后逐渐上升，8周达到高峰，以后则逐渐下降，直到20周以后趋于正常猴水平。见表2及图1。
表2 感染猴不同时期CIC阳性的分布情况
|
组别 |
例数
（n） |
感染后
（week） |
循环免疫复合物（n）及（%） |
阳性率
（%） |
|
<1：8 |
1：8 |
1：16 |
1：32 |
|
SIV感染猴 |
30 |
2 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0% |
|
4 |
21 |
6 |
3 |
0 |
30.0% |
|
8 |
16 |
8 |
6 |
0 |
46.7% |
|
16 |
20 |
4 |
4 |
2 |
33.3% |
|
20 |
28 |
2 |
0 |
0 |
6.7% |
|
28 |
27 |
3 |
0 |
0 |
10.0% |
2.3 SIV感染中、后期及部分猴死亡前的CIC的变化
我们对13只感染了SIV 15~40个月的恒河猴进行不同时期的检测，检测次数共33次。其中阳性次数出现4次，占检测总次数12.1%。出现阳性的猴数为3只，占检测猴数的23%。
在实验的过程中，有4只猴在观察过程中死亡。死亡猴在死前1-2周内CIC测定则显示，有2只猴CIC检测的结果为1:16，另2只猴的检测结果为阴性。即有50％出现了较高水平的CIC，似乎有升高的趋势。
3 讨论
免疫复合物（IC）是机体内与抗原结合的产物，由于抗原抗体的比例不同，所形成的IC分子大小也不同。抗原抗体的比例适当时，形成大分子的不溶性IC，易被吞噬细胞吞噬清除；当抗原过剩时，形成小分子的可溶性IC，可通过肾小球滤孔随尿液排出；但抗原量稍过剩时，形成的中等大小可溶性IC，既不能通过肾小球滤出，又不易被吞噬细胞吞噬清除，长时间游离于血液和其它体液中，形成循环免疫复合物。CIC可在局部沉积，通过激活补体，并在血小板，中性粒细胞的参与下，引起一系列连锁反应而导致组织损伤［2］。
酵母菌凝集试验主要检测I级CIC，其原理为[1]：补体调理的酵母多糖上的补体C3b、C1g可与CIC中IgG Fc段补体结合点黏附，而羊抗人IgG可结合酵母菌上IC中IgG Fc段，形成庞大的网状絮状结构将酵母菌凝集成块，可根据凝集块和絮状物变化，判断CIC的浓度。
我们的研究证实，SIV感染后血浆病毒血症水平在感染后2周左右达到高峰，21天开始下降，到60天左右滴度明显降低甚至测不出[3]。血浆病毒载量水平的检测报道亦与之相符[4]。之后随着疾病的进展，病毒载量水平大多逐渐上升[3,5]。HIV/SIV感染后抗体则普遍出现在第2～4周，至2～3个月时抗体可以达到很高滴度，之后可维持于较高水平[3,5]。
根据SIV抗原与抗体的变化时相，抗原/抗体的比例应存在一由高至低，又逐渐增高的过程，据此可以对本实验的结果解释为：在感染的早期，抗体逐渐形成并释放入血，与循环中大量的病毒抗原结合，形成以病毒抗原为主的IC。随着抗体的增加和抗原的迅速清除，IC的大小与性质也在发生变化，CIC含量升高；直至抗体过剩，CIC降低至正常水平。到AIDS晚期病毒复制增加，CIC可能会有所增加。印度的一项研究表明20.56％的HIV感染者存在CIC，其中75%为HIV特异性的IC，与本试验的结果相近 [6]。
一般而言抗体与抗原的结合有利于将抗原从循环中清除，然而使用抗B细胞治疗已证实，在SIV感染时，SIV特异性抗体对急性期血浆病毒的清除并无影响[7]。相反，过多的CIC可能在沉积于组织，通过活化补体等途径导致组织损伤。另一方面，已证实慢性期循环中的病毒大多是以IC的形式存在的，而其中的SIV仍具有感染能力[8]，因此可能更利于病毒的传播。通过这些途径，CIC有可能参与了HIV/SIV感染导致的免疫缺陷形成。
参考文献：
[1]郭峰.循环免疫复合物测定新方法. 现代红细胞免疫学［M］.第1版. 上海：第二军医大学出版社，2002,109-110
[2]唐福林.风湿免疫科医师效率手册［M］. 第1版. 北京：中国协和医科大学出版社，2001, 59
[3]吴小闲，张奉学，何伏秋，等. 猴免疫缺陷病毒（SIV）慢性感染猴模型的建立[J]. 广州中医药大学学报2000,17(4):355-358
[4]Variablity of viral load in plasma of rhesus monkeys inoculated with simian immunodeficiency virus or simian-human immunodeficiency virus: implications for using nonhuman primate AIDS models to test vaccines and therapeutics. [J] Journal of Virology 2001,75(22): 11234-11238
[5]杰伊 A. 利维.（邵一鸣等主译）. 中和抗体.艾滋病病毒与艾滋病的发病机制[M]. 第1版. 北京：科学出版社，2000， 68-69
[6]Thakar M., Rodrigues J., Randive S., et al. Circulating immune complexes in healthy, HIV-antibody positive subjects[J]. Indian J Med Res. 1991,93:57-61
[7]Jo¨rn E. Schmitz, Marcelo J. Kuroda, Sampa Santra, et al. Effect of Humoral Immune Responses on Controlling Viremia during Primary Infection of Rhesus Monkeys with Simian Immunodeficiency Virus. Journal of Virology. [J] 2003,77(65):2165-2173
[8]Garcia R., Feijoo E., Guerrero MF., et al. Immune complexes from HIV-1+ patients contain infectious virus able to infect normal lymphocytes[J]. J Allergy Clin Immunol. 1996,98(4):827-830
