邓文娣 罗红梅 陈颂 吴小闲
广州中医药大学热带医学研究所 510405
[摘要]目的：探索SIV造模前选择合用的猕猴个体的方法。方法：应用SIV感染前猴PBMC试管内感染SIV的产毒水平与SIV感染猴体内血浆病毒载量水平的关系，选择适于作SIV感染的猴体。结果：根据14只猴的结果，体外与体内的病毒水平符合率为71.43%，体内病毒载量偏低的猴6只（42.9%），体外病毒水平偏低者4只，如把这4只猴排除，则余下10只猴体内病毒载量偏低的猴为3只（30％）。结论：应用检测体外PBMC病毒产量水平的方法，选择病毒水平高的猴才用于体内感染SIV。这样能部分去除体内感染的病毒载量偏低的猴。但最终的解决方法仍是建立培育遗传背景清楚的SPF实验猴群。
[关键词]猕猴属；猴免疫缺陷病毒（SIV）；体外试验；体内试验；病毒水平
猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的猴模型是研究人艾滋病(AIDS)的发病机理、药物筛选、试验治疗、疫苗和免疫调节剂的研制等的最佳动物模型。目前猴子的来源虽逐步从野生过渡到实验饲养、繁殖，供应科学研究使用，但是由于猴子饲养条件高，投资大，繁殖率低等原因，并对其品系遗传特性，微生物感染状况等研究还不足，因而在科研中使用遗传背景清楚，符合无特殊病原的（SPF）的实验猴尚需努力。
SIV最常用于实验感染猴的毒株为SIVmac251，对恒河猴和食蟹猴均敏感，100％感染率，疾病过程与人ADIS酷似，亦有3种型别（急性进展型，一般进展型和慢性进展型）[1]。感染后病毒血症水平大部分较高，少部分偏低[2]。病毒血症水平低的猴不利于评价药物的效果。由于猴子身价昂贵，资源有限，限制了实验用猴的数量。为此试验前选择合适的猴子，才能保证试验的质量。我们比较了感染前猴外周血单核细胞（PBMC）试管内感染SIV的产毒水平与猴感染SIV后体内血浆病毒载量水平的关系，进行分析评价。
1 材料和方法
1.1 实验动物 健康成年食蟹猴，雌雄不限。购买并饲养于广东省灵长类实验动物中心，经血清学检测猴逆转录D型病毒（SRV）、SIV和猴T淋巴细胞性I型病毒（STLV-I）抗体阴性，结核菌素试验阴性。
1.2 SIV病毒及感染 来源于美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士赠予的SIVmac251病毒液，用健康猴PBMC体外增殖病毒，收集后分装、滴定、冻存。以 5 MID100 剂量静脉注射1ml感染实验猴。体内和体外试验用同一病毒液。
1.3 体内试验：SIV感染后，当急性感染病毒血症高峰期降至调定点（set-point），即平台期时，约感染后3个月，从静脉采血，每4周1次，连续4次，共12周，收集的血浆标本送法国巴黎第五大学肿瘤和病毒实验室卢葳教授测定病毒载量。
1.4 体外试验：食蟹猴感染前从静脉采血，常规分离淋巴细胞，用含5μg/ml PHA-P的10% FCS RPMI 1640培基刺激3天，调整细胞浓度为2.0×106/2ml/孔，每标本复孔，24孔培养，以120TCID/ml的SIVmac251感染，换成含IL-2 50 U/ml的培养基，37℃ 5%CO2饱和湿度培养。第2、5天换液1次，第8天细胞病变明显时，作病毒滴定。第11天再测定1次。
病毒滴定：收集的病毒上清从1:200开始作倍比稀释，加入96孔培养板，0.1ml/孔，每滴度复孔，加入3×105/ml的CEMx174细胞，0.1ml/孔，置于37℃ 5％CO2饱和湿度环境培养。每3天换液1次，观察病变结果。
2 结果与分析
2.1 体内试验：食蟹猴26只，经SIVmac251静脉感染后，在病毒平台期采集的4次血浆标本测出的病毒载量，猴与猴间有差异。但同一猴4次标本的差异波动范围一般在2倍以内，故把4次结果的平均值作比较。结果见表1。
表1 26只SIV感染猴调定点血浆病毒载量的分布
Tab .1 Distribution of plasma viral levels in set-point
|
例数
(n) |
SIV RNA载量 copies/ml |
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<103 |
103~104 |
104~105 |
105~106 |
>106 |
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26 |
3 |
5 |
9 |
8 |
1 |
从表1显示，如果以<10,000 copies/ml和>10,000 copies/ml划分，前者属于病毒载量偏低者8只猴，占总数30.8%。即这种猴作评价药物治疗效果使用是不理想的。
2.2 体外试验：食蟹猴14只（即上述体内试验26只猴中的14只），在SIV感染前，取PBMC，在试管内培养，接种SIV，继续培养至第8天细胞病变明显时，收集上清测定病毒滴度，第11天再测定1次。结果病毒高峰在第8天，第11天普遍下降，只有个别猴维持滴度。病毒滴度<10,000 TCID/ml者4只猴，占总数28.5%。
2.3 体内、体外试验病毒产量的比较：两种试验比较了14只猴的病毒产量，结果见图。从图显示，两种试验病毒产量均>10,000 copies/ml或TCID/ml的为7只，均<10,000 copies/ml或TCID/ml的3只，总符合率为71.43%。体内试验14只猴病毒载量<10,000 copies/ml 6只，占42.9%（即病毒载量偏低率），体外试验<10,000 TCID/ml者4只，如把这4只猴去除，余下10只猴体内试验<10,000 copies/ml者3只，病毒载量偏低率30％。可见这14只猴如先用体外试验排除4只病毒滴度<10,000TCID/ml的猴后，才感染SIV，则可以把感染SIV猴的病毒载量偏低率从42.9%降至30％，即可去除病毒载量偏低的感染猴的半数。
图1 体内和体外病毒滴度的比较
Fig.1 Comparison of SIV load in vivo and SIV titre in vitro |
PBMC病毒滴度（viral titre in PBMCs） |
3 讨论
病毒的复制受毒株本身和宿主的多种因素所制约，相同毒株同一剂量、同一途径的感染，其结果则视宿主的遗传背景、免疫状态和微生物感染状况、环境、营养等的差异而出现不同的反应[3,4]。SIV试验感染恒河猴或食蟹猴的结果亦如是。因此，感染后猴体内SIV血浆病毒水平有差异是普遍现象。血浆SIV RNA水平低的个体，往往其病程较长，疾病进展较慢，临床病症、免疫学、血液学、病理学等的变化亦较缓慢[5]，类似慢性进展型。这类感染猴用作药物疗效的评价是不理想的，尤其是评价降低病毒载量的指标上。本试验结果26只SIV感染猴有8只（30.8%）在调定点（set-point）血浆SIV RNA水平<10,000 copies/ml。如果选择动物时能检出和排除这种猴，可有利于药物的评价。本次试验在14只猴体内病毒水平与体外相对应PBMC的产毒量比较，二种试验总符合率为71.43%，如果根据体外试验结果排除病毒产量<10,000 TCID/ml的4只猴，余下10只猴才感染SIV，则体内试验结果血浆病毒载量<10,000 copies/ml 3只，病毒载量偏低率30%，比原来14只猴42.9%的病毒载量偏低率低。
拟用体外PBMC的产毒量来选择感染SIV的试验猴是有一定的价值。然而，这种选择猴的方法，只是目前的暂作考虑。归根结底是要加强国内野生猴群和饲养猴群的种系、亚群等遗传背景的研究，分类驯化，培育出各个品系的SPF实验猴群，科学工作者可根据实验的要求来选择合适的品系，将会大大保证实验质量、稳定性和重复性。
参考文献：
[1]吴小闲，卢耀增，何伏秋，等. 猴免疫缺陷病毒感染猕猴快速进展型死亡特征[J]. 中国医学科学院学报. 2000, 22(1): 71-74
[2]Rober A.Parker, Merediyh M Regan, Keith A. Reimann. Variability of viral load in plasma of rhesus monkeys inoculated with simian immunodeficiency virus or simian-human immunodeficiency virus: implication for using test vaccines and therapeutics. Journal of virology[J]. 2001, 75(22): 11234-11238
[3]Fauci A.S. Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease[J]. Nature 1996, 384 (6609): 529-534
[4]杰伊A. 利维. HIV致病机制的总体特征：长期存活者的预后. 艾滋病病毒与艾滋病的发病机制[M]. 第1版. 北京：科学出版社，2000, 256-261
[5]Staprans, S. I., P. J. Dailey, A. Rosenthal, et al. Simian immunodeficiency virus disease course is predicted by the extent of virus replication during primary infection[J]. J. Virol. 1999, 73:4829-4839
