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张瑞
黑龙江省中医性医学医疗保健中心
黑龙江中医药大学附属二院男科
国内外资料表明，夏枯草中的多糖成分具有抗HSV-1、HSV-2（单纯疱疹病毒）的作用，还具有明显抗HIV-1（人类免疫缺陷病毒）的作用，即抑制HIV-1复制，但其作用的具体机制尚未阐明。此外，白毛夏枯草可影响白细胞介素的产生水平,具有免疫调节作用。我们拟就夏枯草提取物中主要单体成分多糖为主要对象进行研究，以期阐明夏枯草多糖对HIV-1感染者异常免疫状态的调节作用，揭示其抑制HIV-1复制作用机制。以期开发出疗效好，经济适用，符合我国国情的抗HIV药物。
以夏枯草提取物中主要单体成分多糖为主要研究对象进行研究，以期阐明夏枯草多糖在抑制HIV-1复制的同时，对HIV-1感染者异常免疫状态的调节机制。
HIV-1感染的主要特点是CD4+T细胞在数量和功能上出现质和量的缺损，近期研究表明，CD4+T细胞分为1）Th1细胞，主要分泌IL-2、IFN-Y、TNF-Β及TNF-a; 2）Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。Th1型和 Th2型细胞因子互相抑制彼此表型人分化和功能。有专家认为在AIDS疾病发展过程中，有由Th1型反应转向Th2型反应的可能性，主要依据为IL-2、IFN-Y等因子水平下降而IL-4、IL-10等因子的产生增加。有学者证实HIV-1-1能在Th2细胞内复制，因此认为Th2优势应答以及Th2型细胞因子（IL-4、TNF- a、IL-6）的优势分泌是HIV-1得以大量复制，并导致免疫防御缺陷的关键。选择夏枯草多糖对HIV-1感染者TH1/TH2亚群的影响；夏枯草多糖对HIV-1感染者PBMC产生细胞因子水平的影响进行研究，以期探讨夏枯草多糖对免疫功能的调节作用。
实验方法
一、试剂
1． IL-2酶联免疫检测试剂盒，购自深圳晶美生物工程有限公司。
2． IL-4酶联免疫检测试剂盒，购自深圳晶美生物工程有限公司。
3．小牛血清（FCS）购自黑龙江省兽医研究所。
4．完全RPMI1640培养基：10%FCS RPMI1640培养基（GIBCO，USA）。
二、仪器与器材
（1）CO2培养箱（美国 National Appounce公司）
（2）酶联免疫测定仪（北京新技术应用研究所）
（3）超净工作台（苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司）
（4）倒置显微镜（重庆光学仪器厂）
（5）370C培养箱
三、夏枯草多糖的制备：
夏枯草粗粉，95%乙醇回流提取，残渣干燥后，蒸馏水加热提取，提取液浓缩，浓缩物加95%乙醇沉淀，沉淀物洗涤干燥为粗多糖，蒸馏水溶解，溶解液滤除沉淀，滤液sevag法取上清液，加3倍量乙醇，沉淀物洗涤干燥为总多糖，分离纯化为多糖。
四、实验分组与操作：
于24孔细胞培养板中加入健康人外周血单个核细胞，分别设为对照组，高浓度药物组(0.25mg/ml)，中浓度药物组(0.125mg/ml)，低浓度药物组(0.0625mg/ml)，每孔总液量为1ml。
于24孔细胞培养板中加入HIV感染者外周血单个核细胞，分别设为对照组，高浓度药物组(0.25mg/ml)，中浓度药物组(0.125mg/ml)，低浓度药物组(0.0625mg/ml)，每孔总液量为1ml。
细胞培养60小时，每孔取上清500ul，检测细胞因子IL-2、IL-4。
2．IL-2测定
采用ELISA法，按试剂盒使用说明书操作。
3．IL-4测定
采用ELISA法，按试剂盒使用说明书操作。
结果
一、表1夏枯草多糖对PBMC产生IL-2的影响(n=10)（－Ｘ±S）
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健康人PBMC(mg/l) |
HIV感染者PBMC(mg/l) |
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对照组
高浓度药物组
中浓度药物组
低浓度药物组 |
4.10±0.94
3.99±0.78
3.89±0.76
4.05±0.88 |
2.72±0.45 1)**
3.00±0.47 1)**
3.22±0.51 1)** 2)*
2.82±0.53 1)** |
1)与正常对照组比较 2)与感染对照组比较
* : P<0.05 ** : P<0.01
由表1可见，HIV感染PBMC各组IL-2水平明显低于健康人对照组（P<0.01）。但HIV感染的药物中浓度组IL-2水平明显高于非用药对照组（P<0.05）。健康人各组IL-2水平无显著性差异（P>0.05））。提示夏枯草多糖在中浓度下能提高HIV感染PBMC低下的IL-2水平。
二、表2夏枯草多糖对PBMC产生IL-4的影响(n=10)（－Ｘ±S）
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健康人PBMC(mg/l) |
HIV感染者PBMC(mg/l) |
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对照组
高浓度药物组
中浓度药物组
低浓度药物组 |
100.2±28.8
97.5±32.1
96.5±30.2
98.4±27.6 |
103.2±33.5
100.5±28.9
95.6±31.5
94.1±27.6 |
1)与正常对照组比较 2)与感染对照组比较
* : P<0.05 ** : P<0.01
由表2可见，各组之间无显著性差异（P>0.05）。
讨论
HIV-1感染的主要特点是CD4+T细胞在数量和功能上出现质和量的缺损，近期研究表明，CD4+T细胞分为①Th1细胞，主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β及TNF-α；②Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。Th1型和 Th2型细胞因子互相抑制彼此表型的分化和功能。有专家认为在AIDS疾病发展过程中，有由Th1型反应转向Th2型反应的可能性，主要依据为IL-2、IFN-γ等因子水平下降而IL-4、IL-10等因子的产生增加。有学者证实HIV-1能在Th2细胞内复制，因此认为Th2优势应答以及Th2型细胞因子（IL-4、TNF-α、IL-6）的优势分泌是HIV-1得以大量复制，并导致免疫防御缺陷的关键。选择夏枯草多糖对HIV-1感染者TH1/TH2型细胞因子水平的影响进行研究，以期探讨夏枯草多糖对免疫功能的调节作用。
研究结果显示HIV感染者PBMC的TH1型细胞因子IL-2产生水平低下，表明细胞向Th1细胞转化受阻，Th1型细胞因子如IL-2、IFN-γ等减少，而此时Tho向Th2细胞转化相对活跃，在感染者机体T总数减少的情况下TH2型细胞因子IL-4虽未见增多，但Th1/ TH2细胞比例失调，机体免疫功能紊乱。研究表明夏枯草多糖能提高HIV感染者低下的IL-2水平，在一定程度上纠正异常免疫功能状态。 |
