尹春煜1 卢洪洲1 蒋卫民1 胡越凯1 赵清霞2 何云2 孙洪清3 潘孝彰1 翁心华1
1 复旦大学医学院附属华山医院传染病科，上海，200040
2 郑州市第六人民医院传染科，河南郑州，450000
3 上海市传染病医院，上海，200083
[摘要]目的：了解目前我国河南及上海地区HIV感染者p24蛋白编码区的基因变异性以及亚型的分布状况。方法：收集河南及上海地区37份已经证实的HIV-1感染患者的血浆标本并抽提出RNA，其中25份采自于河南，感染途径主要是非法采血；12份采自于上海，主要为经输血制品感染的血友病患者以及经性接触感染者。采用RT-PCR和Nested-PCR的方法扩增所需的目的基因，使用DNA测序仪直接测序；应用CLUSTAL X、PHYLIP等软件对序列进行比对及进化树分析。结果：亚型分析表明所有样本中83.8％为（31/37）为B亚型，在25例河南患者中23例（92％）为B亚型，2例为A亚型；在12例上海患者中8例（66.7％）为B亚型，1例为A亚型，2例为CRF01_AE亚型，1例为CRF02_AG亚型。分别对河南与上海地区的B亚型序列进行分析，与国际共享序列相比，23例河南B亚型的p24编码区中发生核苷酸改变的位点比例为1.6％～4.2％，平均为3.2％；8例上海B亚型核苷酸位点改变的比例为2.0％～3.8％，平均为3.4％。在所有变异位点中均未发现有连续G->A的高度突变。两组B亚型内平均基因离散率分别为3.7％和3.5％，B亚型与其它亚型之间的基因离散率则为11.1％～12.5％。应用CLUSTAL-X分别得出河南及上海地区各自的B亚型共享序列并与国际共享序列进行比对，发现这两个共享序列产生氨基酸变异的比例均为2.2％（5/231），其中有3个变异位点相同，分别为A14P、I91V及E180D，而这两个共享序列之间的差异却极小，仅为0.9％（2/231）。进化树分析亦表明所有样本中大多为B亚型，且所有来自河南的B亚型样本以及大部分上海的B亚型样本多与源自泰国的B’亚型相距较近。结论：我国河南及上海地区HIV感染以B亚型较为多见，两地区的B亚型之间有较高的同源性，且p24蛋白有共同的氨基酸变异位点。
[关键词] HIV-1；变异；序列
人类免疫缺陷病毒１型（HIV-1）由于其缺乏校正酶，使得其在复制时出错的频率较高，约为10-4~10-5/位点/代，因而比其他的病毒具有较高的基因多样性[1]。p24蛋白是由gag基因编码产生的衣壳蛋白，是病毒的重要组成部分，同时其表面具有多个抗体结合位点，在免疫机制中也发挥重要作用。采用RT-PCR的方法，测定中国河南和上海地区部分HIV-1感染者血浆HIV-RNA gag基因相应编码区的序列，进行初步的亚型分析，并了解这些地区HIV感染者中p24蛋白编码区的基因变异性。
1 材料和方法
1.1 患者资料：本次共收集全血样本37份，均经ELLISA初筛试验阳性并经Western blot法确认。其中25份采自于河南（由郑州市第六人民医院提供），12份采自于上海。37个患者中，男性24例，女性13例，年龄最大74岁，最小4岁，平均年龄39岁。发现感染的时间大多在2001－2003年，推测可能已感染时间自4年至10年，大多在7－8年。有六人已开始抗病毒治疗，时间自2个月至2年不等。25例河南患者的感染途径主要是非法采血，而12例上海患者主要为经输血制品感染的血友病患者以及经性接触感染者。
1.2 HIV-RNA的抽提：采用EDTA抗凝的全血经离心后分离出血浆，使用QIAGEN公司提供的病毒RNA抽提试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，标号52904），具体操作按照说明书描述的步骤进行，每个病人的血浆用量为200ul，按照所要求的比例逐步加入缓冲液、乙醇等，最后提取的RNA溶于50ul DEPC处理的水中，分装在10ul的小管中，立即行逆转录或者保存于-70℃。
1.3 RT-PCR：以gag基因为目标基因，首先进行逆转录，RT引物为G01 （5’-AGGGGTCGTTGCCAAAGA-3’），逆转录酶采用Gibco/BRL公司生产的M-MLV，RNA模板用量为10ul，具体反应体系及操作步骤按说明书，于37℃延伸70分钟，最后在70℃15分钟灭活酶。
1.4 Nested-PCR：为提高反应的敏感性和特异性，采用巢式PCR方法扩增目的基因。同时为了减少普通Taq酶在PCR扩增时产生的较高的错配率，选用高保真的DNA聚合酶（Pfu，由MBI公司生产）代替普通Taq酶进行扩增反应。第一轮反应的引物为G10 （CAGTATTAAGCGGGGGAGAATT）和G01，在50ul反应体系中含有1×buffer(含镁离子)、100nmol dNTP、1.25U Pfu、25pmol 引物及10ul c-DNA 模板（RT产物），反应条件为95℃3分钟；95℃30秒、52℃1分钟、72℃2分钟，35个循环；72℃10分钟。
第二轮PCR反应中片段1的引物分别为G20 （GTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAA）与G55（ATTTCTCCCACTGGGATAGGTGG片段2的引物分别为G70 （ATGAGGAAGCTGCAGAATGGG）与G25（ATTGCTTCAGCCAAAACTCTTGC）。50ul反应体系中含有1×buffer(含镁离子)、100nmol dNTP、1.25U Pfu、25pmol 引物及2ul DNA 模板（第一轮产物）, 反应条件为95℃3分钟；95℃30秒、55℃45秒、72℃90秒，30个循环；72℃10分钟。
1.5 PCR产物的纯化：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，确认分别在680bp及480bp可见明显目标条带，然后采用纯化试剂盒进行割胶纯化，纯化后的产物用于核酸序列测定。
1.6 核酸序列测定：分别以G20和G70为测序引物，使用ABI公司的荧光标记末端终止物循环测序试剂盒进行测序反应，最后应用ABI公司的PRISM 377全自动DNA序列分析仪进行序列测定。
1.7 序列分析：使用Lasergene软件中的Seqman对原始序列进行核对及拼接，使用HIV BLAST程序(参见http://hiv-web.lanl.gov)寻找数据库中已公布的相似序列，初步判断亚型并排除可能的实验错误，应用NCBI的Subtyping工具进一步明确亚型；以HXB2为参照序列定位出所需的p24蛋白编码区序列，应用CLUSTAL W（版本号1.81）对所有序列进行排序及比对；应用PHYLIP软件包（版本号3.6a3）对序列进行同源性及系统树分析并构建进化树，其计算方法采用邻位相连法（Neighbor-joining），距离模式采用Kimura 2-parameter。
2 结果
2.1 RT-PCR结果：使用巢式PCR的方法对37份样本gag基因进行了扩增，扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。所有样本均可得到2条特异性的DNA条带，长度分别为680bp及484bp。
2.2 HIV-1亚型分析：通过HIV BLAST确定所获得的序列均为HIV-1的gag序列，经亚型分析明确37份样本中31份（83.8％）为B亚型，3份（8.1％）为A亚型，2份（5.4％）为CRF01_AE亚型，1份（2.7％）为CRF02_AG亚型。而在25例河南患者中23例（92％）为B亚型，2例为A亚型；在12例上海患者中8例（66.7％）为B亚型，1例为A亚型，2例为CRF01_AE亚型，1例为CRF02_AG亚型。
2.3 p24蛋白编码区序列分析：以HXB2为参照序列定位出所需的p24蛋白编码区序列，长度为693bp。应用CLUSTAL-X分别对河南及上海地区B亚型的p24序列进行排序及比对，得出河南及上海地区各自的B亚型共享序列（p24_B HN Cons及p24_B SH Cons）；分别将每个样本的p24序列与取自于HIV-Database中B亚型gag基因的国际共享序列（CONSENSUS_B）进行比对，找出发生改变的位点。
灰色为G>A，黑色为非G>A。p24_B HN Cons为河南地区的B亚型共享序列，下同。
图1 河南23例B亚型p24蛋白编码区序列变异位点
灰色为G>A，黑色为非G>A。p24_B SH Cons为上海地区的B亚型共享序列，下同。
图2 上海8例B亚型p24蛋白编码区序列变异位点
在23例河南B亚型的患者中（图1），与国际共享序列相比，发生核苷酸改变的位点比例为1.6％～4.2％，平均为3.2％；在所有发生的变异位点中，为A->G的占21.6％，G->A占24.8％，两者相仿。而在8例上海B亚型的患者中（图2），发生核苷酸改变的位点比例为2.0％～3.8％，平均为3.4％；在所有发生的变异位点中，为A->G的占21.3％，G->A占17.6％。所有样本中均未发现由连续的G->A的转换所导致的高度突变（hypermutation）[2]。
采用配对比较的方法，应用PHYLIP软件包中的DNADIST计算p24基因编码区各亚型内及亚型间的基因离散率，发现河南地区B亚型内的基因离散率为0.0～7.5％，平均为2.9％，B亚型与A亚型之间平均的基因离散率为11.5％；上海地区B亚型内的基因离散率为0.1～6.2％，平均为3.5％，B亚型与CRF01_AE、CRF02_AG以及A亚型之间的基因离散率分别为12.4％、11.7％以及12.5％。
根据所测得的核苷酸序列推测可能的p24蛋白氨基酸序列，将31例B亚型的序列分别与B亚型共享的p24氨基酸序列（CONSENSUS_B）进行比对，在23份来自河南的样本中发生氨基酸改变的比例为0.9％～3.8％，平均为2.8％；8例来自上海的样本中发生氨基酸改变的比例为1.6％～3.6％，平均为3.2％。
将河南及上海地区各自的B亚型共享序列（p24_B HN Cons及p24_B SH Cons）与国际共享序列CONSENSUS_B进行比对（图3），发现两者氨基酸的变异位点产生比例相同，均为2.2％（5/231）。其中有3个变异位点相同，分别为A14P、I91V及E180D。而p24_B HN Cons与p24_B SH Cons之间的差异却极小，仅为0.9％（2/231）。
图3 河南、上海地区p24蛋白共享序列的变异性
2.4 进化树分析：应用Neighbor-joining方法对所有序列进行进化树分析，参考序列包括CONSENSUS_A、CONSENSUS_B、CONSENSUS_CRF01及CONSENSUS_CRF02（分别为A亚型、B亚型、CRF01及CRF02的国际共享序列，取自于HIV-Database）、HXB2（B亚型）、M38429（B亚型）、U71182（B’亚型），可以看出所有来自河南的B亚型样本以及大部分上海的B亚型样本与源自泰国的B’亚型相距较近，而与源自欧美的B亚型相距较远，上海的B亚型中仅有两个（样本xu和D04）离B亚型较近；其他的A亚型、CRF01、CRF02亚型的样本则分别聚集在一起（图4）。
3 讨论
相对保守的p24蛋白作为HIV的一种重要抗原，具有细胞毒性T淋巴细胞直接作用和结合的位点，在免疫反应中起重要作用，也是多种免疫治疗措施的重要靶位[3]。体内针对p24抗原的抗体与疾病的进展呈密切负相关。由于HIV-1病毒在复制时的易错倾向，使得病毒在基因水平上不断产生变异，充分认识并了解这些变异，对于免疫机制的研究、疫苗研制等方面都会有重大帮助[4,5]。
通过CLUSTAL-X分别对我国河南和上海地区B亚型HIV-1的p24序列进行排序及比对，找出各个序列中的发生改变的位点。在总长度为693bp的p24编码区中，在23例河南B亚型的患者中发生核苷酸改变的位点比例为1.6％～4.2％，平均为3.2％；氨基酸改变的比例为0.9％～3.8％，平均为2.8％。 8例上海B亚型的患者中发生核苷酸改变的位点比例为2.0％～3.8％，平均为3.4％；氨基酸改变的比例为1.6％～3.6％，平均为3.2％，两组之间变异程度相似。在所有发生的变异位点中，A->G与G->A所占的比例相仿。
由于宿主细胞内供给氨基酸前体的量的不平衡以及逆转录酶的错配倾向，HIV-1在复制时可能会出现“高度突变”，表现为较多而无序排列的同一碱基转换，通常为G->A，结果产生无复制能力的病毒，对于病毒种系发育的研究会产生严重干扰。经核对，本组样本中均未发现此现象发生；且均未发生碱基缺失及插入突变。
与env区8～17％这样较高的个体间变异率相比[6]，gag基因变异率稍低，Yoshimura等[7]报道p24编码区在个体内的变异率为0.4～2.5％，在个体间的变异率为2.7～5.9％。通过对我国河南及上海地区37例HIV感染者的p24基因编码区分析，发现河南和上海B亚型内的基因离散率分别为3.7％和3.5％，两者相似；而B亚型与其他亚型之间的基因离散率均超过10％。
亚型分析表明在我国河南和上海地区大多数HIV感染为B亚型（83.8％），但具体比例在两个地区有所差别。河南患者中较为单一，其中绝大多数（92％）为B亚型，另有部分为A亚型；而上海患者中则较为复杂，B亚型约占2/3，仍居多数，但其他亚型（包括CRF01、CRF02和A亚型）也占了约1/3。这一点可能与两地患者感染途径的不同有关。河南患者绝大多数系通过非法采血所感染，容易造成单一病原体的迅速扩散，而上海患者感染途径较复杂，包括输血或血制品、性接触和静脉吸毒，因而病原体也可能较为多样。进化树分析亦表明在我国HIV感染B亚型较为多见，且多为与泰国株相近的B’亚型，与文献报道的一致[8]。其中河南的B亚型均位于B’附近，说明其很可能源于东南亚[9]，并且河南与云南的HIV感染者之间有较为密切的关系。
将河南及上海地区各自的B亚型共享序列进行比对，发现两者之间的氨基酸序列差异较小，仅为0.9％，说明河南及上海地区B亚型的p24区有较高的同源性，但是与国际共享序列比较则有一定的差异（2.2％）。这些变异的发生对于该地区B亚型HIV-1的p24蛋白抗原表位的变化有重要意义。
虽然HIV病毒在机体内持续存在的机制尚未完全明确，但其较高的基因变异性可以部分解释原因[10]。p24蛋白总体上看仍相对保守，在免疫治疗及疫苗研究中，针对不同地区和不同亚型，尽量避免已知可能发生变异的区域而选择较保守的区域，则会取得更好的效果。
CONSENSUS_A, CONSENSUS_B, CONSENSUS_CRF01, CONSENSUS_CRF02（分别为A, B, CRF01, CRF02 亚型的共享序列, 来源于HIV-Database）, HXB2（B亚型）, M38429（B亚型）, U71182（B’ 亚型）
图4 进化树分析
参考文献：
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